多能干细胞如何鉴定？这些方法你需要知道

多能干细胞（PSC，pluripotent stem cell）凭借其无限自我更新和产生三个胚层细胞的能力，被誉为再生医学的革命性发现。多能干细胞研究领域也成为群雄逐鹿的竞技场。

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那么鉴定多能干细胞需要几个步骤？

 

  • 三步：培养、分化、验证

  • 在检测阶段，同时对多个细胞表面特异性标志物的表达进行鉴定可以确定细胞干性是否完整；

  • 随后，定向分化为各个胚层的细胞；

  • 最后，经各胚层标志物的鉴定证实其成功分化，从而确认 PSC 是具有功能的。

 

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图片来源：GIPHY

 

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培养与分化必备神器

 

首先进行 PSC 的培养，R&D Systems® 最具代表性的 Activin A、BMP-4、FGF Basic 和独有的 Wnt-3a 等蛋白，三重 QC 验证确保蛋白的高活性和批次间稳定性，为 PSC 的培养和分化保驾护航。

 

中国科学院动物研究所周琪课题组与李伟课题组发表在 Cell 上的研究发现，小鼠发育过程中的第一次细胞命运决定事件在 2-细胞胚胎时期就发生，是发育生物学领域的重要突破[1]。

 

研究中使用 R&D Systems® 的 Activin A 和 FGF Basic 重组蛋白，用于培养小鼠上胚层干细胞（mEpiSCs）。

 

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干细胞培养常用重组蛋白

 

此外高品质的 Tocris® 的小分子化合物不仅适用于重编程，还可以维持干性。邓宏魁教授课题组在小分子化合物诱导多能干细胞产生和转分化领域具有深厚的造诣，几项研究中均使用到 Tocris® 的小分子化合物，如 TINPB、A83-01 等[2-4]。

 

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体细胞重编程为 iPSC 的小分子化合物一览表

 

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ESC 和 iPSC 培养及干性维持相关小分子化合物

 

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少量样本鉴定多能干细胞的 3 种技能

 

如果你希望简化繁琐的实验流程，这里推荐一个集培养、分化、验证 PSC 于一身的神器：人 PSC 功能鉴定试剂盒（R&D Systems®，货号 SC027B），仅需 5 天就可以完成整个过程。，我们用该神器总结出，用少量样本在 24 孔板上鉴定 PSC 的三种简易方法。

 

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1

基于三胚层分化的鉴定

 

使用人 PSC 功能鉴定试剂盒分别分化 iBJ7 人诱导多能干细胞和 BG01V 人胚胎干细胞。分化结果由免疫细胞化学（ICC）评估各胚层标志物：内胚层标志物 SOX17、中胚层标志物 Brachyury，外胚层的标志物则为 Otx2。

 

相应分子的检测抗体已经包含在试剂盒中，细胞核由 DAPI（蓝色）复染。下图中，各胚层的标志物都有明显的检测信号，验证了 PSC 成功分化为三个胚层。

 

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2

基于固相抗体芯片的鉴定

 

固相抗体芯片作为一种高通量工具，可以在一个样本中快速半定量检测多种蛋白。在鉴定干细胞胚层分化中，是否也可以利用这个利器？我们先来看一个实例。

 

在 24 孔板中培养 BG01V 人胚胎干细胞（ESC），并用人 PSC 功能鉴定试剂盒将 ESC 分化为内胚层、中胚层及外胚层。

 

当细胞达到合适的分化程度，直接添加单孔的细胞裂解物至固相抗体芯片上，按照 Proteome Profiler™ Human Pluripotent Stem Cell Array Kit（R&D Systems®，货号 ARY010）的操作说明，快速检测 15 种不同的多能干细胞和分化细胞标志物的相对表达水平。

 

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未分化的 ESC 中 Oct-3/4 高表达，而三胚层分化后，Oct-3/4 低表达，各胚层特异性标志物表达量增高。B）抗体芯片的实验结果由免疫细胞化学（ICC）验证：内胚层 (Goat Anti-Human SOX17 Polyclonal Antibody；R&D Systems®，货号 AF1924)，中胚层 (Goat Anti-Human Snail Polyclonal Antibody；R&D Systems®，货号 AF3639)，外胚层 (Goat Anti-Human Otx2 Polyclonal Antibody；R&D Systems®，货号 AF1979)。

 

3

基于活细胞成像的鉴定

 

活细胞和组织的成像是揭示细胞动力学和功能的常用工具，该工具是否能与干细胞鉴定结合呢？

 

GloLIVETM 抗体是采用不含叠氮的干细胞标志物抗体与 NorthernLights™ 荧光染料偶联，在免疫细胞化学（ICC）检测中，用于活的胚胎干细胞/多能干细胞染色。此类抗体的特点如下：

 

  • 在目标细胞群选择前验证标志物的表达，鉴定多能性；

  • 仅需 30 分钟孵育时间，节约时间成本；

  • 不影响细胞增殖或干性，便于继续培养并安排后续实验。

 

使用 GloLIVETM 偶联的 SSEA-1（人干细胞多能性阴性标志物）和 SSEA-4（人干细胞多能性阳性标志物）抗体也可以验证 PSC 的多能性。

 

实验中，用人 PSC 功能鉴定试剂盒分化 BG01V 人胚胎干细胞（ESC），在分化过程的特定时间点（第 0 天，2 天和 4 天）用 GloLIVETM 偶联的 SSEA-4 抗体 (绿色，货号NLLC1435G) 和 GloLIVE TM 偶联的 SSEA-1 抗体 (红色，货号 NLLC2155R) 染色 ESC。

 

如预期所示，人 ESC 分化的标志是 SSEA-4 表达量降低，而 SSEA-1 表达量增高。细胞核由 DAPI（蓝色）复染。

 

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以上三种方法可以轻松、日常地验证多能干细胞群。实验均可在 24 孔培养和分化的细胞上进行，节约实验样本。PSC 的验证可以确保下游实验的细胞品质，增加结果的一致性和可靠性。

 

 

不止于 PSC，Bio-Techne 拥有间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞等各类干细胞研究的整体解决方案，囊括分化和培养、分离和鉴定、研究等常见流程，实现从 RNA 到蛋白水平解析干细胞奥秘，促进干细胞研究的医学转化。

 

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